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高效液相色谱仪测定氨基酸的含量

发布时间:2017/02/07 点击量:


1  L--色氨酸含量的测定
1.1 实验仪器与试剂
色氨酸样品,甲醇, 液相色谱仪梯度系统,UV紫外检测器,7725I手动进样阀,N2000色谱工作站,0.03%KH2PO4溶液
1.2 HPLC色谱分析条件
流动相为0.03%KH2PO4溶液(A)-甲醇(B),线性梯度淋洗,流速1.0mL/min,柱温 35℃,检测波长276nm。
流动相 时间(t/min)
 5 10 15 20
A(%) 80 90 80 70
B(%) 20 10 20 30
1.3 标准溶液的配制
精密称取色氨酸标准标准品50mg,置100ml容量瓶中,振摇,用流动相溶解到刻度,作为供试品溶液,另取色氨酸样品适量,同法操作。
1.4 标准直线的制作
精密称取色氨酸标准样品适量 ,分别稀释制成每1ml 中含色氨酸50.0、100.0、200.0、400.0、600.0、800.0、1000.0μg 的溶液,注入液相色谱仪,以色氨酸峰面积A为纵坐标,浓度C为横坐标,制作回归标准直线。
1.5 发酵液中样品中色氨酸含量的测定
取发酵液,稀释配制成约 500μg/ ml 的溶液,摇匀,过滤,取25μl进样,在高效液相色谱仪下测量,记录峰值面积,作图。
2 L-精氨酸含量的测定
2.1 实验仪器与试剂
L-精氨酸标准样品,乙腈, 液相色谱仪梯度系统,紫外检测器,7725I手动进样阀,N2000色谱工作站,磷酸二氢铵。
PH计,磷酸,
2.2  HPLC色谱分析条件
流动相: 以磷酸二氢铵溶液 ( 称取磷酸二氢铵1.15g, 加水800m溶解后, 用磷酸调节pH 值至2.0±0.1, 加水稀释至 1000ml ) - 乙腈为流动相,线性梯度淋洗; 柱温为30℃检测波长为206nm;进样量:25μl。
2.3 标准直线的制作
精密称取精氨酸标准标准品50mg,置100ml 容量瓶中,振摇,用流动相溶解到刻度,作为供试品溶液,另取色氨酸样品适量,同法操作。精密称取精氨酸标准样品适量 ,分别稀释制成每1ml 中含精氨酸50.0、100.0、200.0、400.0、600.0、800.0、1000.0μg 的溶液,注入液相色谱仪,以精氨酸峰面积A为纵坐标,浓度C为横坐标,制作回归标准直线。
2.4 发酵液中样品中精氨酸含量的测定
取发酵液,稀释配制成约 500μg/ ml 的溶液,摇匀,过滤,取25μl 进样,在高效液相色谱仪下测量,记录峰值面积,作图。

3 L-甘氨酸含量的测定
3.1 实验仪器和试剂
    乙酸铵溶液;乙腈;L-甘氨酸标准样品; 液相色谱仪梯度系统,紫外检测器,7725I手动进样阀,N2000色谱工作站。
3.2 HPLC色谱分析条件
流动相:A为0.02%mol/L乙酸铵溶液(PH=6.5):B为乙腈,线性梯度淋洗;流速: 110 mL/min ;柱温:30℃;进样量:20μL。
梯度洗脱表3
流动相 时间(t/min)
 10 20 30 40 50 60
A(%) 80 60 40 40 60 80
B(%) 20 40 60 60 40 20
3.3 标准直线的制作
方法同2.2节
3.4 发酵液中样品中甘氨酸含量的测定
     方法同2.5节

4 L-甲硫氨酸含量的测定
4.1   实验仪器和试剂
   L-甲硫氨酸标准样品;甲醇;醋酸钠; 液相色谱仪梯度系统,UV紫外检测器,7725I手动进样阀,N2000色谱工作站。
4.2   HPLC色谱分析条件
流动相: A为甲醇 , B为 50 mmol /L的醋酸钠缓冲溶液;流速1 . 0 mL /min;梯度洗脱见表1,测定波长为 262 nm,柱温为30℃。
梯度洗脱表4
流动相                 时间(t/min)
 10 20 30 40 50 60
A(%) 30 50 80 85 100 100
B(%) 70 50 20 15 0 0
4.3   标准直线的制作
方法同2.2节
4.4   发酵液中样品中甲硫氨酸含量的测定
     方法同2.5节
5 回收率实验
  称取甘氨酸标准液50μg/ml分别稀释0、1、2、4、6、8、10倍,每份取1ml,按标准样品处理方法,过滤,测定标准样品中的甘氨酸的含量,计算回收率。
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